Western Blot là một kỹ thuật phân tích được sử dụng thoáng rộng rãi nhằm mục tiêu tiềm năng phát hiện những protein chuyên biệt trên những mẫu mô hay dịch chiết xuất mô.
Chúng ta đang xem: Phương pháp western blot
Phương pháp này sử dụng điện di trên gel để phân tách những protein còn nguyên vẹn bằng cấu trúc 3D hay protein đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide. Protein này sau đó sẽ được chuyển lên màng (thường sử dụng là màng nitrocellulose hay màng PVDF), ở đó chúng được gắn bằng những kháng thể đặc hiệu với protein tiềm năng. Điện di trên gel sẽ được đưa vào khối khối hệ thống phân tích Western Blot nhằm mục tiêu tiềm năng xử lý những vấn đề của những phản ứng chéo cánh cánh trong những kháng thể.
Nguồn ảnh: http://proteomics.case.edu/proteomics/westernblot.html
1. Nguyên tắc
Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (Kháng nguyên – Kháng thể). Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang
2. Quy trình tiến hành
Bước 1:Xử lý mẫu
Lấy mẫu từ toàn bộ mô hay môi trường thiên nhiên thiên nhiên tự nhiên nuôi cấy tế bào. Trước tiên, xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học sử dụng máy nghiền, sử dụng máy đồng hóa hoặc siêu âm. Những mẫu virus hay mẫu lấy trừ trong môi trường thiên nhiên thiên nhiên tự nhiên nuôi cấy cũng thậm chí là nguồn protein xác định được trong Western Blot. Thêm những loại chất tẩy rửa, muối và dung dịch đệm để ly giải tế bào và hòa tan protein
Bước 2:Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân tách những protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp những yếu đuối hèn tố trên.
Phương pháp điện di thông dụng nhất là điện di trên gel polyacrylamide và mang bổ sung cập nhật update sodium dodecyl sulfate (SDS). Phương pháp SDS – PAGE (điện di trên gel polyacrylamide và mang bổ sung cập nhật update SDS) giữ những polypeptide ở trạng thái biến tính sau lúc chúng được xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc 2, cấu trúc bậc 3.
Những mẫu được nạp vào trong số giếng của người tiêu dùng dạng gel. Thường để lại một giếng cho chỉ thị (marker) hoặc thang chuẩn chỉnh chỉnh ladder, là một thành phầm thương mại mang chứa hỗn hợp những protein với khối lượng phân tử xác định được nhuộm để thậm chí tạo ra band màu và tìm thấy được. Lúc điện thế được thiết lập trên gel, protein chính thức dịch rời với vận tốc ko giống nhau tùy từng khối lượng phân tử của chúng. Vận tốc ko giống nhau của những protein (sự khác lạ về độ di động điện di) sẽ tạo thành vạch ko giống nhau trên mỗi giếng.
Bước 3:Chuyển protein gel lên màng lai
Để những protein thậm chí phát hiện được kháng thể thì protein phải được chuyển từ gel lên màng lai. Phương pháp chính để chuyển những protein được gọi là phương pháp thẩm tách điện là sử dụng một dòng điện để kéo những protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Những protein được chuyển lên màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp như trên các bạn dạng gel. Thành tựu là protein sẽ được phơi ra trên lớp mỏng manh manh mặt phẳng để tiến hành xác định
Bước 4:Xử lý màng lai (Blocking)
Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên thường tiến hành quy trình để ngăn chặn links giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác định protein tiềm năng. Việc ngăn chặn những links ko đặc hiệu bằng phương pháp đặt màng vào dung dịch protein loãng albumin huyết tương bò 3-5 % (BSA) hoặc sữa bột ko béo trong Tris – Buffered saline (TBS). Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở toàn bộ những vị trí mà protein đích chưa gắn vào. Do đó lúc kháng thể được bổ sung cập nhật update vào, sẽ không còn hề chỗ bám trên màng ngoại trừ những vị trí links đặc hiệu với protein đích. Điều này làm tránh nhiễu cơ các bạn dạng trong thành phầm sau cùng của Western Blot, cho hậu quả rõ rệt và ngoại trừ hiện tượng dương tính giả.
Bước 5:Quy trình lai và phát hiện vị trí lai
Để phát hiện những protein chuyên biệt, màng được dò protein yêu chuộng bằng kháng thể đã đổi khác mang kinh nghiệm links với enzyme thông tin, enzyme này lúc kết thích nghi với một cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang và tạo màu. Quy trình này ra thị giác gồm 2 bước:
– Màng lai đã thắt chặt và thắt chặt và cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu được tao ra lúc cho vật chủ hay môi trường thiên nhiên thiên nhiên tự nhiên nuôi cấy tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein yêu chuộng.
– Sau lúc rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa links, màng tiếp đến gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) mang gắn enzyme (thường sử dụng horseradish peroxidase). Nối tiếp ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Đặt một tấm phim ngạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện những điểm sáng sủa sủa phát ra do enzyme.
Mà thậm chí sử dụng nhiều phương pháp để phát hiện kháng thể thứ cấp: sử dụng bức xạ hồng ngoại sắp links với kháng thể gắn chất huỳnh quang, sử dụng khắc ghi phóng xạ
3. Ứng dụng
– Xác định sự sinh hoạt của gel trải qua sự xuất hiện của protein trong mô.
– Nhận dạng protein tiềm năng.
– Nhận xét tính chuyên biệt của kháng thể.
– Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus tạo ra: thử nghiệm xác định HIV, viêm gan B.
– Năm 2002, đã ứng dụng thành công phương pháp Western Blot trong việc xác định kháng nguyên giun đũa chó (Toxocara canis) trên thỏ (Olga Lucia Morales và ctv, 2002), mở ra một hướng đi mới trong việc xét nghiệm chẩn đoán đúng mực những bệnh ký sinh trùng trên người.
Xem thêm: Tải trò chơi Candy Crush Saga Miễn Phí Cho Điện Thoại Andoird, Ios
Tài liệu xem thêm
Olga Lucia Morales, 2002. Identification of Toxocara canis antigen by Western Blot in experimentally infected rabbits.Rev. Inst. Med.trop. S. Paulo44 (4):213 – 216. http://biology.vn/phuong-phap-western-blot/
Phân mục: Tổng hợp
