Hỏi đáp

Phương Pháp Western Blot Là Gì, Phương Pháp Western Blot – viettingame

Xét nghiệm sinh hóaXét nghiệm huyết họcXét nghiệm máu tụ – miễn dịchXét nghiệm nước tiểu – vi sinhXét nghiệm di truyền & SHPT

*

*

*

*

*

Nhóm thiết bị làm lạnhNhóm thiết bị làm nóngNhóm thiết bị cơ họcNội thất Phòng thí nghiệmCân/pH/Lọc/Pipet/Bơm…

Đang xem: Western blot là gì

Phẩm màu hóa chất cơ bạn dạng/phân tíchHóa chất sinh họcSinh phẩm xét nghiệmPipet/Vật tư tiêu haoHóa chất sinh học phân tử
Những kỹ thuật phân tíchCác kỹ thuật lấy mẫuPhân loại môi trườngCác dự án công trình môi trường xung quanh – Chuyển giao công nghệMôi trường và cuộc sống thường ngày
viettingame.com

*

nguồn ảnh: http://proteomics.case.edu/proteomics/westernblot.html

Phương phápWestern blot(hay còn được gọi làprotein immunoblot) là mộtkỹ thuật phân tíchđược sử dụng thoáng rộng nhằm mục đích phát hiện cácproteinschuyên biệt trên những mẫu mô hay dịch chiết xuất mô. Phương pháp này sử dụngđiện di trên gelđể phân tách những protein còn nguyên vẹn bằng cấu trúc 3-D hay protein đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide. Protein này sau đó sẽ được chuyển lên màng (thường sử dụng là màngnitrocellulosehay màngPVDF), ở đó chúng được gắn bằng cáckháng thểđặc hiệu với protein đích.Điện di trên gel được đưa vào khối hệ thống phân tích Western Blot nhằm mục đích xử lý vấn đề củacác phản ứng chéogiữa những kháng thể.

Nhiều siêu thị phẩm màu hóa chất chuyên hỗ trợ những kháng thể (cả kháng thểđơn dòngvà kháng thểđa dòng) tương ứng vời hàng trăm protein không giống nhau.Những kháng thể thương mại thường xuyên có giá thành cao, tuy vậy kháng thể ko links thậm chí tái sử dụng giữa những thí nghiệm. Phương pháp này được sử dụng nhiều trong số nghành củasinh học phân tử,miễn dịch genvà những ngành sinh học phân tử khác. Một số trong những dụng cụ tìm kiếm, như làCiteAb, Antibodypedia, và SeekProducts, thậm chí được sử dụng sẽ giúp những nhà phân tích tìm kiếm những kháng thể thích hợp để sử dụng trong phương pháp Western Blot.

Những phương pháp liên quan khác bao hàm phương pháp lai phân tử (dot blot),hóa mô miễn dịchvàhóa tế bào miễn dịch, ở đó những kháng thể được sử dụng để phát hiện những protein trên mô và tế bào bằng cáchnhuộm miễn dịch, và hấp thụ miễn dịch lên links enzyme (ELISA).

Quá trình tiến hành

Sẵn sàng mô

Nên lấy mẫu từ toàn bộ mô hay canh trường (môi trường xung quanh nuôi cấy) tế bào. Trước nhất, xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học như sử dụngmáy nghiền(lúc lượng mẫu to), sử dụngmáy đồng hóa(máy nghiền đồng thể) hoặcsiêu âm(với số lượng mẫu nhỏ). Cũng thậm chí phá hủy tế bào bằng một trong số phương pháp hóa học như trên. Tuy nhiên, những mẫu virus hay mẫu lấy từ môi trường xung quanh cũng thậm chí là nguồn protein xác định được trong Western Blot, ko nên phải là phân tích tế bào.

Thậm chí sử dụng những loạichất tẩy rửa, muối, vàđệmđể thúc đẩy ly giải tế bào và hòa tan protein.Thường bổ sung cập nhật lượng chất kìm hãm proteasevàphosphataseđể ngăn chặn sự phá hủy mẫu bằng chính những enzyme với trong mẫu. Nên tiến hành sẵn sàng mô ở nhiệt độ thấp để tránh hiện tượngbiến tính proteinvà suy tránh (mất tính năng).

Phối hợp kỹ thuật hóa sinh và cơ học – bao hàm nhiều phương pháp lọc vàly tâm– thậm chí được sử dụng để phân tách những thành phần tế bào và cácbào quankhác nhau

Điện di trên gel

Điện di trên gelđể phân tách những protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trênđiểm đẳng điện(pI),khối lượng phân tử, điện tích, hoặc phối hợp những yếu đuối tố trên. Điểm lưu ý (thực chất) của quy trình phân tách tùy thuộc vào giải pháp xử lý mẫu và Điểm sáng của bạn dạng gel. Trên đây là một cách rất hữu ích (hiệu suất cao) để xác định protein.

Tính đến nay, phương pháp điện di được sử dụng thông dụng nhất là điện di trên gelpolyacrylamidevà với bổ sungsodium dodecyl sulfate(SDS). Phương phápSDS-PAGE(điện di trên gel polyacrylamidecó bổ sung cập nhật SDS) giữ những polypeptide ở trạng thái biến tính sau lúc chúng được xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc 3 (ví dụ, cầu disulfide tạo ra những nhóm sulfhydryl ) và do đó cácprotein đượcphân táchdựa trên khối lượng phân tử. Protein trong mẫu mang điện tích âm do SDS sẽdịch chuyển tới cực dương trải qua mạngacrylamidecủa bạn dạng gel (dịch rời qua mạng lưới acrylamide tới cực dương). Những protein nhỏ hơn dịch rời nhanh chóng hơn qua màng và do đó chúng được phân tách theo khối lượng (thường sử dụng đơn vị kilodaltons,kDa). Nồng độ acrylamide xác định thời gian làm việc phân tách của gel – nồng độ càng tốt thì phân tách càng tốt những protein với khối lượng phân tử nhỏ. Nồng độ acrylamide càng thấp, thì phân tách càng tốt hơn những protein với khối lượng phân tử to hơn. Protein dịch rời theo một hướng dọc bạn dạng gel trong hầu hết những màng lai. (Tìm hiểu thêm về phương pháp SDS- PAGE tại trên đây).

Những mẫu được nạp vào trong số giếng của bạn dạng gel. Thường để lại một giếng làm chochỉ thị (marker) hoặc thang chuẩn chỉnh (ladder), là một thành phầm thương mại với chứa hỗn hợp những protein với khối lượng phân tử xác định, được nhuộm để thậm chí tạo ra băng màu và tìm thấy được. Khiđiện thếđược thiết lập trên gel, protein chính thức dịch rời với những vận tốc không giống nhau tùy thuộc vào khối lượng phân tử của chúng. Vận tốc dịch rời không giống nhau của những protein (sự khác lạ vềđộ di động điện di) sẽ tạo thành vạch không giống nhau trên mỗi giếng.

Cũng thậm chí sử dụng gel hai chiều (two-dimensional (2-D) gel) để phân tách protein từ một mẫu duy nhất theo hai chiều. Theo chiều thứ nhất, protein được phân tách dựa trên điểm đẳng điện (pH tại đó protein mang điện tíchtrung tính), và chiều thứ hai theo khối lượng phân tử của protein.

Chuyển lên màng lai

Đểprotein thậm chí links được với những kháng thể đặc hiệu, gel phải được chuyểnlên màngnitrocellulosehaypolyvinylidene difluoride(PVDF). Phương pháp chính để chuyển những protein được gọi là phương phápthẩm tách điệnvà sử dụng một dòng điện để kéo những protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Những protein được dịch rời từ gel lên màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bạn dạng gel. Một phương pháp khác (cũ) trong sự dịch chuyển protein bao hàm việc đặt màng lên trên mặt bạn dạng gel, rồi đặt tiếp một tấm giấy lọc lên trên. Đặt giấy lọc cả trong dung dịch đệm, dung dịch đệm thậm chí thấm lên giấy lọc bằnglực mao dẫn, và mang theo cả protein. Trên thực tiễn, phương pháp này ko được sử dụng vì như thế tốn nhiều thời hạn, thẩm tách điện thường được sử dụng nhiều hơn nữa.

Thành tựu của một trong hai quy trình “lai thấm” (thẩm tách miễn dịch) là protein sẽ được phơi ra trên lớp mặt phẳng (bềmặt lớp mỏng tanh) để tiến hành phát hiện(sẽ được trình diễn dưới). Cả hai loại màng được tìm bởi đặc tính links ko đặc hiệu với protein (ví dụ, thời gian làm việc links với toàn bộ những protein là đương đương). Link protein dựa trên tương tác kị nước, cũng như tương tác điện tích giữa màng và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn màng PVDF, nhưng mỏng tanh hơn và ko bền nếu tái sử dụng.

Thậm chí kiểm tra sự thống nhất và hiệu suất cao ở đầu cuối của quy trình chuyển protein từ gel lên màng bằng phương pháp nhuộm màng với chất nhuộmCoomassie Brilliant BluehoặcPonceau S. Ponceau S thường được sử dụng nhiều hơn nữa bởi vì nó với độ nhạy cao và tính tan trong nước, làm cho chất nhuộm dễ dẫn đến rửa trôi và dò màng như sẽ được mô tả ở phần sau.

Blocking

Từ lúc màng được tìm với thời gian làm việc links với protein, cả kháng thể và protein đích đều là protein, nên cần tiến hành công việc để ngăn chặn links giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác nhận protein tiềm năng. Ngăn chặn những links ko đặc hiệu bằng phương pháp đặt màng vào dung dịch protein loãng- điển hình nổi bật làalbumin huyết tương bò3-5% (BSA) hoặcsữa gầy(cả hai đều phải sở hữu giá thành thấp) trongTris-Buffered Saline(TBS) hoặc I-Block, với Xác Suất chất tẩy rửa nhỏ(0.1%) nhưTween 20hoặcTriton X-100. Protein trong dung dịch loãng sẽ khóa toàn bộ những vị trí mà protein đích chưa gắntrên màng. Do đó, lúc bổ sung cập nhật kháng thể, nó sẽ không còn thể gắn ko đặc hiệu ngoài việc gắn với protein đích. Điều này làm tránh cơ bạn dạng sự nhiễutrong quátrìnhWestern Blot, cho thành quả rõ và loại trừ hiện tượng dương tính giả.

Sự phát hiện

Trong quy trình phát hiện, màngcó thời gian làm việc links với enzyme thông tin; enzyme này lúc tác dụng với một cơ chất tương ứng, sẽ thúc đẩy phản ứng phátquang và tạo màu. Vì như thế nhiều nguyên nhân, điều này thường ra mắt trong một quy trình gồm hai bước, tuy vậy hiện nay phương pháp phát hiện một bước vẫn được vận dụng cho những ứng dụng nhất định.

Hai bước

Kháng thể sơ cấp được tạo ra lúc cho vật chủ hay canh trường tế bào miễn dịch (môi trường xung quanh nuôi cấy tế bào miễn dịch) tiếp xúc với protein ưa chuộng (hoặc một phần của nó). Thường thì, trên đây là một phần trong thỏa mãn nhu cầu miễn dịch, kháng thể thu nhận và sử dụng như một dụng cụ xác định đặc hiệu mà thậm chí links trực tiếp với protein.

Xem thêm: Tải B612 Về Máy Tính Pc Windows Phiên Bạn dạng Mới Nhất, B612 Cho Windows Phone

Sau lúc phong bế (blocking), ủ dung dịch loãng của kháng thể sơ cấp (thường sử dụng nồng độ giữa 0.5 và 5 micrograms/mL) với màng và lắc nhẹ nhàng. Thường thì, dung dịch này bao hàm dung dịch muối đệm với một lượng nhỏ chất tẩy rửa và thỉnh thoảng cũng đều có thêm sữa bột hoặc BSA. Dung dịch kháng thể và màng thậm chí được giữ và ủ lại với nhau ở cùng một nơi trong vòng 30 phút tới qua đêm. Cũng thậm chí được ủ ở những nhiệt độ không giống nhau, với nhiệt độ càng tốt càng thúc đẩy links, cả links đặc hiệu (so với protein đích, “tín hiệu”) và protein ko đặc hiệu (“nhiễu”).

Sau lúc rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa links, màng nối tiếp được gắn kháng thể thứ hai (thứ cấp), được bám trực tiếp vào phần đặc hiệu theo loài của kháng thể sơ cấp. Những kháng thể với nguồn gốc động vật (hoặc canh trường hybridoma nguồn gốc động vật); kháng chuột thứ cấp sẽ links với hầu hết những kháng thể sơ cấp ngẫu nhiên nào với nguồn gốc từ chuột, điều này cho phép tiết kiệm ngân sách và chi phí kinh tế cho toàn bộ phòng thí nghiệm bởi cso thể sử dụng chung một nguồn kháng thể trong sản xuất kháng thể hàng loạt, và hỗ trợ thành quả ổn định theo thời hạn. Kháng thể này được tìm đến như là kháng thể thứ cấp, và do đó nó với Điểm sáng hướng đích, với Xu thế được gọi là “kháng- chuột” “kháng-dê,” vv. Kháng thể thứ cấp thường được links vớibiotinhoặcenzymechỉ thị nhưalkaline phosphatasehayhorseradish peroxidase. Điều này tức là nhiều kháng thể thứ cấp sẽ links với một kháng thể sơ cấp và khuếch đại tín hiệu.

Phổ cập nhất là sử dụng kháng thể thứ cấp gắnhorseradish peroxidaseđể tách tác nhân phát quang hóa học, và thành phầm phản ứng phát rahuỳnh quangtỷ lệ với lượng protein. Một tấm film với độ nhạy cao của film tự sướng được đặt vào màng, và tiếp xúc với ánh sáng sủa từ phản ứng tạo ảnh của kháng thể links lai (blot). Kinh tế của phương pháp này thấp hơn tuy nhiên ít nhạy hơn lúc sử dụng phương pháp nhuộm4-chloronaphtholvới 1%hydrogen peroxide; phản ứng của những gốc peroxide với 4-chloronaphthol tạo ra một vệt tím sẫm thậm chí chụp được ảnh mà ko cần sử dụng film tự sướng chuyên sử dụng.

Như với quy trìnhELISPOTvàELISA, enzyme phản ứng với cơ chất của một phân tử sẽ được chuyển đổi tạo thành phầm phản ứng tạo màu thậm chí phát hiện trên màng (quan sát hình bên với những dải màu xanh).

Một phương pháp khác để phát hiện kháng thể thứ cấp sử dụng bức xạ hồng ngoại (NIR) sắp links với kháng thể gắn chất huỳnh quang. Ánh sáng sủa huỳnh quang ko thay đổi được tạo ra từ sự thúc đẩy của lượng chất nhuộm huỳnh quang, làm cho sự phát hiện huỳnh quang đúng đắn hơn và là thước đo đúng đắn cho sự không giống nhau trong tín hiệu được tạo ra bới những kháng thể được ghi lại links với những protein trong phương pháp Western Blot. Thậm chí định lượng protein một cách đúng đắn bằng những tín hiệu được tạo ra bởi lượng protein không giống nhau trên màng được đo trong trạng thái tĩnh, lúc so sánh với sự phát quang hóa học, trong đó ánh sáng sủa được đo trong trạng thái động.

Phương pháp thứ ba là sử dụng ghi lại phóng xạ thay vì như thế enzyme kèm theo với kháng thể thứ cấp, như gắn một protein links kháng thể như Protein A củaStaphylococcushay Streptavidin với chất đồng vị phóng xạ iot. Tính từ lúc lúc những phương pháp khác đáng tin cậy hơn, nhanh chóng hơn và kinh tế thấp hơn Thành lập và hoạt động, phương pháp này hiện nay rất ít được sử dụng; tuy nhiên, một lợi thế của phương pháp này là độ nhạy của kỹ thuật tự sướng phóng xạ- tự động, cho phép định lượng protein với độ đúng đắn cao lúc phối hợp cùng với ứng dụng quang học (vd. Optiquant).

Một bước

Trong lịch sử hào hùng, quy trình dò được tiến hành theo hai bước bởi tạo ra kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp trong số quy trình riêng lẻ là tương đối dễ. Điều này mang lại cho phân tích viên và những tổ chức phân tích những lợi thế rất rộng như linh động và bổ sung cập nhật bước khuếch đại trong quy trình phát hiện. Với sự Thành lập và hoạt động của phân tích protein hiệu năng cao và giới hạn thấp của sự phát hiện, tuy nhiên, người ta vẫn ưa chuộng tới việc phát triển khối hệ thống dò tìm một bước mà cho phép quy trình ra mắt nhanh chóng hơn và ít tốn xoàng hơn. Điều này cần tới kháng thể dò vừa với thời gian làm việc nhận ra protein ưa chuộng vừa đựng nhãn thậm chí xác định, đầu dò thường được tìm đến như làđuôi protein. Ủ đầu dò sơ cấp với màng theo cách tương tự như với kháng thể sơ cấp trong quy trình hai bước, sau đó sẵn sàng để xác định trực tiếp theo lúc rửa nhiều lần.

Phương pháp Western Blot sử dụng khối hệ thống phát hiện phóng xạ.

Sự phát hiện / Sự hiển thị

Sau lúc rửa những đầu dò ko gắn lên màng, màng lai đã sẵn sàng phát hiện đầu dò đã ghi lại và links với protein ưa chuộng. Trong thực tiễn, ko phải toàn bộ đều triệu chứng protein chỉ trên một băng trên màng. Khối lượng sắp đúng được xác định bằng phương pháp so sánh những băng nhuộm với những chỉ thị hoặc thang chuẩn chỉnh lúc điện di. Quy trình cũng thường được tiến hành so với protein cấu trúc, như actin hay tubulin, mà protein dạng này ko nên thay đổi giữa những mẫu. Lượng protein tiềm năng được định mức so với những protein cấu trúc để kiểm soát giữa những nhóm. Một giải pháp tốt hơn là việc định mức tổng số protein được hiển thị với trichloroethanolhayepicocconone.Điều này thực tiễn đảm bảo điều chỉnh tổng số protein trên màng trong trường hợp với sai sót hoặc quy trình chuyển lên màng ko được hoàn thiện.

Xác định màu

Phương pháp xác định màu tùy thuộc vào quy trình ủ của Western Blot với cơ chất phản ứng với enzyme để chỉ thị (nhưperoxidase) mà links với kháng thể thứ cấp. Nó sẽ chuyển đổi những thuốc nhuộm hòa tan này thành dạng ko tan của màu khác kết tủa ngay tại vị trí enzyme gắn và do đó làm màng hiện màu. Quy trình hiện màu tạm dừng sau lúc rửa chất nhuộm tan. Review mức độ triệu chứng của protein thông quamật độ kế(nhuộm đậm tới mức nào) hayquang phổ kế.

Xác định sự phát quang hóa học

Phương pháp xác định sựphát quang hóa họcphụ thuộc vào quy trình ủ của Western Blot với cơ chất phát quang lúc được tiếp xúc với chất chỉ thị gắn trên kháng thể thứ cấp. Ánh sáng sủa phát ra thu được bằng máy chụp CCD mà thậm chí bắt được ảnh kỹ thuật số của màng lai hoặc bằng phim ảnh. Phương pháp sử dụng phim để phát hiện màng lai đang từ từ biến mất bởi sự phi tuyến tính của hình ảnh (định lượng ko đúng đắn). Hình ảnh được phân tích bằng tỷ lệ kế, đo lượng tương đối protein nhuộm và định lượng thành quả theo tỷ lệ quang. Ứng dụng mới cho phép phân tích nhiều hơn nữa những dữ liêụ như khối lượng phân tử nếu như sử dụng đúng loại chất. Những tập đoàn thường hỗ trợ khối hệ thống hình ảnh Phát quang hóa học Analytik Jena, Syngene, UVP, Azure Biosystems, UVITEC, GE và Biorad.

Xác định phóng xạ

Phương pháp ghi lại phòng xạ ko cần cơ chất enzyme, nhưng hơn thế, phải đặt film X-quang trực tiếp trước màng lai, mà được phát triển như là phơi nó lên dấu phóng xạ và tạo vùng tối tương tứng với băng protein ưa chuộng (quan sát hình ảnh phía bên phải). Vai trò của phương pháp ghi lại phóng xạ đang tránh dần bởi sự nguy hiểm của phóng xạ, kinh tế cao, tác động to tới tình trạng sức khỏe và sự đáng tin cậy của người tiêu dùng, và thường được thay thế bằng ECL (tăng cường phát quang hóa học) là một sự lựa tìm hữu ích.

Xác định huỳnh quang

Đầu dò ghi lại huỳnh quang được thúc đẩy bằng ánh sáng sủa và xác định ánh sáng sủa phát ra bằng cảm ứng quang như máy chụp CCD được trang bị bộ lọc ánh sáng sủa tương ứng mà thu được hình ảnh kỹ thuật số của màng lai và thậm chí tiến hành phân tích hơn thế nữa về khối lượng phân tử và phân tích định lượng trên màng lai. Phương pháp ghi lại huỳnh quang được xem xét như là phương pháp tốt nhất để định lượng nhưng độ nhạy xoàng hơn phương pháp phát quang hóa học.

Dò thứ cấp

Một sự khác lạ to giữa màng nitrocellulose và màng PVDF liên quan tới thời gian làm việc hỗ trợ “việc tách” loại những kháng thể và tái sử dụng màng cho kháng thể đầu dò tiếp theo. Trong lúc với nhiều quy trình tốt thiết lập để tách loại kháng thể trên màng nitrocellulose, sự vững chắc và kiên cố hơn của màng PVDF cho phép sự tách loại đơn giản dễ dàng hơn, và tái sử dụng được nhiều hơn nữa trước lúc thí nghiệm bị giới hạn bởi sự nhiễu trên nền. Một điểm khác lạ nữa là không như màng nitrocellulose, màng PVDF phải được lắc trong ethanol 95%, isopropanol hay methanol trước lúc sử dụng. Màng PVDF thường xuyên có Xu thế dày hơn và thời gian làm việc chống lại những yếu đuối tố gây hại cao hơn trong quy trình sử dụng.

Điện di trên gel 2-D

Phương pháp điện di SDS-PAGE 2- chiều sử dụng những nguyên tắc và kỹ thuật trình diễn ở trên. Như tên thường gọi phương pháp điện di SDS-PAGE 2- chiều, liên quan tới việc dịch rời của những polypeptides theo 2D. Thí dụ, theo chiều thứ nhất, những polypeptide sẽ được phân tách dựa trênđiểm đẳng điện, trong lúc theo chiều thứ hai, những polypeptide được phân tách dựa theotrọng lượng phân tửcủa chúng. Điểm đẳng điện của protein nhất định được xác định bởi số lượng tương đối những amino acid tích điện dương (thí dụ. lysine, arginine) và những amino acid tích điện âm (thí dụ. glytamate, aspartate), với những amino acid tích điện âm góp thêm phần tạo ra điểm đẳng điện thấp và những amino acid tích điện dương góp thêm phần tích cực tạo ra điểm đẳng điện cao. Những mẫu cũng thậm chí được phân tách trước hết trong ĐK ko rút gọn sử dụng SDS- PAGE và dưới ĐK rút gọn ở chiều thứ hai, làm tách rời links disulfide mà với vai trò giữ những tiểu đơn vị với nhau. SDS-PAGE cũng thậm chí kết phù hợp với ure – PAGE tạo ra một gel hai chiều.

Xem thêm: Horror Games – Play Ghost Hunters

Về nguyên tắc, phương pháp này cho phép phân tách toàn bộ những protein tế bào trên một gel to duy nhất. Một ưu thế to của phương pháp này là nó thường phân biệt sự khác nhaugiữa những đồng dạng của một loại protein riêng biệt- thí dụ một protein đã được phosphoryl hóa (bằng phương pháp bổ sung cập nhật nhóm tích điện âm). Protein đã được phân tách ra thậm chí được cắt ra khỏi gel và sau đó được phân tích bằng phương phápquang phổ khốiđể xác định potein.

Về Viettingame.com

Viettingame.com - Chuyên trang web tổng hợp những thông tin hữu ích trên internet như thông tin về game, tin tổng hợp
Xem tất cả các bài viết của Viettingame.com →

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai.